Газета «Новости медицины и фармации» №1 (778), 2022
Вернуться к номеру
Міжнародний стандарт ВООЗ і показник BAU як кількісний індикатор нейтралізуючих антитіл при COVID-19
Авторы: Мельник О.О., к.б.н.
ТОВ «ЛАБІКС», м. Київ, Україна
Рубрики: Инфекционные заболевания
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Перший випадок коронавірусного захворювання COVID-19, спричинений вірусом SARS-CoV-2, був зареєстрований у грудні 2019 р. (м. Ухань, Китай). У березні 2020 р. Всесвітня організація охорони здоров’я (ВООЗ) оголосила про всесвітню пандемію, яка продовжується досі [1]. Із 31 грудня 2019 р. по 20 грудня 2021 року в 194 країнах світу було зареєстровано 275 298 531 підтверджений випадок захворювання та 5 373 552 смерті, одужали 247 018 847 осіб [2]. Аналіз антитіл до SARS-CoV-2 був і залишається важливим у боротьбі з пандемією COVID-19 [3–5]. З самого початку пандемії FDA (Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів, США) видало дозволи на використання в надзвичайних ситуаціях (Emergency Use Authorizations, EUA) для сотень серологічних наборів із метою лабораторного підтвердження діагнозу COVID-19 [6]. Дані FIND (Фонд інноваційних нових діагностичних засобів) свідчать про те, що станом на квітень 2021 р. існує не менше 655 імунологічних наборів на антитіла, які або комерційно доступні, або знаходяться в стадії розробки. У даний час тестування на антитіла може надати цінні дані щодо епіднагляду та епідеміологічної оцінки для визначення імунізаційного статусу населення [7, 8], діагностики підозрілих випадків при негативному тесті на вірус РНК [9–11], підбору гіперімунної плазми для конвалесцентної плазмотерапії [12, 13], розробки терапевтичних антитіл [14, 15], визначення імунної відповіді та стійкості вакцин проти COVID-19 [16, 17].
Перші системи тестування на антитіла до SARS-CoV-2 були розроблені для того, щоб відрізнити людей з інфекцією COVID-19 від тих, хто все ще не був інфікований новим вірусом [18]. Тому ці імуноаналізи зазвичай розроблялися як якісні, а не кількісні тести, виробники ставили перед собою мету досягнення максимально можливої специфічності й високої чутливості, для чого використовувалися різні антигени. По суті, можна виділити два типи аналізів — на основі нуклеокапсиду (NC) та шипоподібного глікопротеїну коронавірусу (S-білок), який є основною мішенню для нейтралізації антитілами, служить для зв’язування з рецептором та злиття з клітинною мембраною при проникненні вірусу [19]. У більшості інфікованих людей антитіла, спрямовані проти SARS-CoV-2 на специфічні нуклеокапсидні антигени, рано індукуються через типову сильну імуногенність вірусного нуклеокапсиду. Крім того, дуже висока специфічність досягається за рахунок цільової модифікації антигену нуклеокапсиду таким чином, щоб не було перехресної реактивності навіть з близькими спорідненими вірусами. Однак властивості таких нуклеокапсидів на основі цих антитіл залишаються неясними, і ці маркери інфекції навряд чи будуть функціонально значущими для забезпечення захисту або імунітету. З іншого боку, антитіла, які реагують із S-білком, діють інакше. Було показано, що S-зв’язуючі антитіла виконують функцію нейтралізуючих антитіл. Таким чином, не дивно, що численні дослідження виявили хорошу кореляцію між зв’язуванням S-спайкових білків з нейтралізуючими антитілами [20–22]. У контексті вакцин проти SARS-CoV-2 саме ці нейтралізуючі антитіла мають першорядне значення.
Основна мета активної імунізації — викликати появу багатьох нейтралізуючих антитіл, специфічних для SARS-CoV-2, які ідеально запобігають проникненню вірусу та сприяють зупиненню системного поширення, запобігаючи захворюванню. Деякі з методів для визначення нейтралізуючої активності мають суттєві обмеження. Так, аналізи з живими вірусами вимагають 3-го рівня біобезпеки, а метод псевдотипування дуже трудомісткий і характеризується низькою пропускною здатністю [23–25]. Класичні тести на антитіла, які вимірюють реактивність антитіл у сироватці/плазмі з певними антигенами, можуть виконуватися дуже швидко і з високою продуктивністю. У зв’язку з цим дослідження антитіл проти S-спайкових білків відіграють важливу роль. Тим не менше ці тест-системи повинні надійно визначати кількість антитіл, специфічних до SARS-CoV-2, рівні яких можна порівняти один з одним і мати відмінну кореляцію з наявністю нейтралізуючих антитіл. У кампанії з вакцинації серед серологічних тестів важливу роль відіграли антитіла проти рецептор-зв’язуючого домену (RBD), субодиниці S1 та full Spike (S). Однак було зазначено, що результати досліджень сильно відрізняються в клінічних ситуаціях через відсутність контрольного матеріалу для стандартизації кількісних тестів при визначенні нейтралізації SARS-CoV-2 [26]. Тому виникла потреба в розробці відповідного кількісного стандарту.
Перший міжнародний стандарт ВООЗ для імуноглобуліну G проти SARS-CoV-2
Зараз, в епоху вакцинації проти COVID-19, додається ще одна важлива роль серології SARS-CoV-2, а саме визначення специфічних антитіл після активної імунізації. Для цього було розроблено перший Міжнародний стандарт ВООЗ для імуноглобуліну G проти SARS-CoV-2 (код NIBSC 20/136) з метою гармонізації оцінки імунної відповіді після природної інфекції або вакцинації [27]. Наявність Міжнародного стандарту для антитіл спростить стандартизацію серологічних методів SARS-CoV-2, дозволить порівнювати та узгоджувати дані наборів між лабораторіями. Це допоможе визначити рівні антитіл, які необхідні для ефективності дії вакцин та терапевтичних засобів, а також покращити наше розуміння епідеміології вірусів у рамках епідеміологічних та імунологічних досліджень. Розробка Міжнародного стандарту була організована Національним інститутом біологічних стандартів та контролю (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) у співпраці з ВООЗ за сприяння Коаліції за інновації у забезпеченні готовності до епідемій (Coalition for Epidemic Preparedness Innovations, CEPI). Міжнародні стандарти (IS) визнані еталонними матеріалами вищого рівня для біологічних речовин, їх значення виражають у міжнародних одиницях (IU). Вони використовуються для кількісної оцінки біологічної активності, що присутня у зразку, що дозволяє порівнювати аналізи з різних лабораторій та відображати порівнянні результати. Це дає можливість краще визначати як аналітичний параметр (чутливість тестів), так і клінічний параметр (захисні рівні антитіл)
Розробка Міжнародного стандарту ВООЗ на антитіла проти SARS-CoV-2
Зразки для дослідження
Міжнародним стандартом антитіл проти SARS-CoV-2 (код NIBSC 20/136) є ліофілізований препарат пулу плазми від 11 пацієнтів, які одужали від SARS-CoV-2 (Англія, Великобританія). Матеріал був зібраний через 28 днів після появи перших симптомів. Зразки кожного пацієнта оброблені з використанням детергенту, щоб мінімізувати ризик вірусів [28]. Крім того, вони були перевірені на наявність вірусних маркерів (антитіла до ВІЛ, HBsAg та HCV). Приблизно 3500 скляних DIN-ампул об’ємом 2,5 мл, що містять 0,25 мл об’єднаної плазми, були ліофілізовані 11 червня 2020 р. Первинне сушіння проводили при –35 °C протягом 40 годин при вакуумі 100 мкбар, наступне сушіння із поступовим збільшенням температури до 25 °C — протягом 10 годин, потім 30 годин вторинного сушіння при 25 °C і вакуумі 30 мкбар. Флакони були заповнені сухим азотом до атмосферного тиску та герметизовані.
Учасники дослідження
П’ятдесят одна лабораторія погодилася брати участь у дослідженні, проте троє учасників із материкового Китаю не змогли отримати зразки для спільного дослідження через час, необхідний для оформлення дозволу на ввезення. Чотири лабораторії не надали результатів вчасно для включення до звіту про спільне дослідження. Таким чином, 44 учасники, що подали включені результати, були з 15 країн, що охоплюють 6 континентів: Австралія (4), Бразилія (1), Канада (1), Китай (1), Німеччина (3), Індія (1), Італія (1), Японія (1), Кенія (1), Нідерланди (2), Саудівська Аравія (1), Сінгапур (1), Південна Корея (3), Великобританія (11) та Сполучені Штати Америки (12). У дослідженні використано 125 методів, включаючи ELISA, аналізи нейтралізації, проточну цитометрію, імуноаналізи латерального потоку, інгібуючі аналізи та один аналіз подвійного зв’язування антигену. Препарат-кандидат, зразок G, код NIBSC 20/136, оцінювався як частина сліпої панелі зразків, яка включала плазму і сироватку від пацієнтів, які одужали після SARS-CoV-2, для оцінки комутативності та узгодженості результатів. Чотири пули плазми пацієнтів, які одужали, були включені в дослідження і розділені на зразки з високим, середнім і низьким титром антитіл.
Результати дослідження
У листопаді 2020 р. підсумки дослідження були подані у ВООЗ. Результати показали, що міжлабораторна варіація скоротилася більше ніж у 50 разів для аналізів нейтралізації і в 2000 разів для тестів ELISA відносно Міжнародного стандарту і була прийнята Комітетом експертів ВООЗ із біологічної стандартизації 10 грудня 2020 р. Міжнародний стандарт заснований на об’єднаній людській плазмі пацієнтів, які одужали, ліофілізований в ампулах, із призначеною одиницею, що становило 250 міжнародних одиниць (МО) на ампулу для нейтралізації.
Таким чином, пулірувана плазма від 11 пацієнтів з SARS-CoV-2, зразок G, код NIBSC 20/136, встановлена як Міжнародний стандарт ВООЗ на антитіла проти SARS-CoV-2. У початковому проєкті, розісланому учасникам, була запропонована загальна довільно призначена одиниця 250 МО/амп. для кількісного визначення нейтралізуючих антитіл проти антигенів SARS-CoV-2. Інструкція із застосування запропонованого Міжнародного стандарту ВООЗ подана на рис 1.
/4_m.jpg)
Результат аналізу виражається у міжнародних одиницях стандарту ВООЗ — First WHO International Standart for anti-SARS-CoV-2 inmunoglobulin (human), NIBSC code: 20/136 «BAU-binding antibody units (одиниці зв’язуючих антитіл)». Оскільки ці одиниці виміру є уніфікованими для IgG SARS-CoV-2, вони не вимагають перерахунку, на відміну від інших одиниць виміру (Од/мл, AU/мл тощо). Щоб привести свою систему до міжнародних одиниць, компанія-виробник має придбати таку ампулу. Далі її необхідно розвести в дистильованій воді та провести тест на антитіла. Виходячи із співвідношення BAU (яке відоме) та результату аналізу самої компанії, можна отримати коефіцієнт для перерахунку (рис. 2).
/4_m2.jpg)
Улітку 2021 року Всесвітня організація охорони здоров’я затвердила Міжнародний стандарт вимірювання — First WHO International Standart for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulinum (human), з одиницею виміру BAU (Binding Antibody Units, одиниці зв’язуючих антитіл).
Кожна фірма-виробник таких тест-систем обов’язково повинна перевести їх на ці нові одиниці виміру. Приведення до єдиного стандарту допомагає в уніфікації серологічних методів дослідження SARS-CoV-2 та полегшує поточні дослідження імунної відповіді на вірус, пов’язаної із природною інфекцією, вакцинацією та терапевтичним лікуванням. Таким чином, можливо регулярно проводити дослідження на підставі існуючих штамів вірусу, відстежувати здатність організму людини захищатися від нової інфекції у зв’язку з мутацією та появою нових штамів, проводити корекцію існуючих даних.
Прикладом є робота, виконана в лабораторії клінічної хімії університетської клініки «Тор Вергата» (Рим, Італія), де було протестовано шість різних комерційних наборів, що використовуються у всьому світі для визначення IgG до SARS-CoV-2 [29]. Вісімдесят вісім послідовних зразків сироватки (співвідношення жінки : чоловіки — 1,4 : 1, середній вік — 57,0 ± 14,0 року) пройшли скринінг на антитіла до S-білка. Когорта дослідження складалася зі змішаної популяції (вакциновані пацієнти, які одужали від COVID-19, здорові пацієнти). Усі аналізи виконувались відповідно до вимог виробника та інструкцій. Характеристики різних оцінюваних серологічних тестів подані в табл. 1.
/4_m3.jpg)
Таким чином, дані різних тест-систем, які зараз використовуються, необхідно привести до єдиного знаменника — міжнародної одиниці BAU. Лабораторії повинні видавати висновки не лише зі своїми цифрами, як було раніше, а й зазначати кількість BAU в одному мілілітрі крові (BAU/мл). Тепер можна самим пацієнтам перерахувати всі свої тести. Для цього необхідно взяти попередній аналіз та подивитися, тест якого виробника був зроблений раніше (це вказано в бланку), отриманий результат помножити або розділити на коефіцієнт, як зазначено в табл. 2.
У пацієнтів уже зараз є можливість самостійно розшифрувати свій аналіз, якщо в лабораторіях використовують тест-системи різних фірм і цифри у них сильно відрізняються. Використовуючи дані шкали захисту імунітету від COVID-19 (табл. 3) з урахуванням вмісту одиниць BAU/мл, можна легко інтерпретувати отриманий результат.
/5_m.jpg)
Висновок
Всесвітня організація охорони здоров’я затвердила Міжнародний стандарт вимірювання — First WHO International Standart for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulinum (human) (NIBSC code: 20/136) з одиницею виміру BAU (binding antibody units, одиниці зв’язуючих антитіл). Таке приведення до єдиного стандарту допоможе в розшифровці та полегшить поточні дослідження імунної відповіді на вірус SARS-CoV-2, пов’язаної з природною інфекцією, вакцинацією та терапевтичним лікуванням. Для визначення рівнів імуноглобулінів до SARS-CoV-2 необхідно використовувати набори реагентів для кількісного визначення антитіл, а результати досліджень подавати з використанням умовних одиниць виміру BAU/мл (binding antibody units, одиниці зв’язуючих антитіл). Стандартизація імунної відповіді на COVID-19 за Міжнародним стандартом ВООЗ на анти-SARS-CoV-2 імуноглобулін полегшує порівняння клінічних досліджень шляхом вираження результатів аналізів нейтралізації з різних лабораторій з огляду на Міжнародний стандарт. Цей стандарт використовується в наборах для діагностики та моніторингу нещодавно перенесеної коронавірусної інфекції, у тому числі безсимптомного перебігу захворювання, контролю напруженості поствакцинального імунітету до S-білка SARS-CoV-2 при імунізації вакцинами, для виявлення перехворілих на коронавірусну інфекцію COVID-19 та оцінки ефективності вакцинації.
Список литературы
Список літератури знаходиться в редакції