Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

Журнал «Здоровье ребенка» 2 (45) 2013

Вернуться к номеру

Рецепторная основа механизмов развития локального воспаления слизистой оболочки желудка у детей с хеликобактерной инфекцией

Авторы: Герасименко О.Н., Государственное учреждение «Днепропетровская медицинская академия Министерства здравоохранения Украины»

Рубрики: Гастроэнтерология, Педиатрия/Неонатология

Разделы: Клинические исследования

Версия для печати


Резюме

В статье приведены данные о роли факторов рекогниции врожденного иммунитета в развитии локального воспаления слизистой оболочки желудка у детей с хеликобактерной инфекцией. Целью исследования явилось изучение роли механизмов распознавания липополисахарида Helicobacter pylori (Н.pylori) в развитии локального воспаления слизистой оболочки желудка у детей с хеликобактерной инфекцией. Под наблюдением находилось 55 детей в возрасте от 10 до 16 лет, больных хроническим Н.pylori-ассоциированным гастродуоденитом (28 пациентов, основная группа) и хроническим гастродуоденитом, не ассоциированным с Н.pylori (27 детей группа сравнения), в стадии обострения. Показано, что в основе развития инфекционно-воспалительного процесса, вызванного Н.pylori, и его неблагоприятного течения лежит функциональный дефицит неспецифических механизмов защиты желудочно-кишечного тракта. Приведены особенности экспрессии Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) в биоптате слизистой оболочки желудка и содержания протеина sCD14 в сыворотке крови детей, больных хроническим гастродуоденитом в стадии обострения. Показано, что развитие у детей хронического гастродуоденита, ассоциированного с Н.pylori, сопровождается повышением экспрессии в биоптате слизистой оболочки желудка TLR4, который является ключевым сенсором для липополисахарида Н.pylori, и низким уровнем TLR4-аксессуарного протеина sCD14.

У статті наведені дані про роль факторів рекогніції вродженого імунітету в розвитку локального запалення слизової оболонки шлунка в дітей із хелікобактерною інфекцією. Метою дослідження було вивчення ролі механізмів розпізнавання ліпополісахариду Helicobacter pylori (Н.pylori) у розвитку локального запалення слизової оболонки шлунка в дітей із хелікобактерною інфекцією. Під спостереженням перебували 55 дітей у віці від 10 до 16 років, хворих на хронічний Н.pylori-асоційований гастродуоденіт (28 пацієнтів, основна група) та хронічний гастродуоденіт, не асоційований з Н.pylori (27 дітей, група порівняння), у стадії загострення. Показано, що в основі розвитку інфекційно-запального процесу, викликаного Н.pylori, і його несприятливого перебігу лежить функціональний дефіцит неспецифічних механізмів захисту шлунково-кишкового тракту. Наведені особливості експресії Toll-подібного рецептора 4 (TLR4) в біоптаті слизової оболонки шлунка і вмісту протеїну sCD14 у сироватці крові дітей, хворих на хронічний гастродуоденіт у стадії загострення. Показано, що розвиток у дітей хронічного гастродуоденіту, асоційованого з Н.pylori, супроводжується підвищенням експресії в біоптаті слизової оболонки шлунка TLR4, який є ключовим сенсором для ліпополісахариду Н.pylori, і низьким рівнем TLR4-аксесуарного протеїну sCD14.

The article presents data on the role of factors for innate immunity recognition in the development of local inflammation of the gastric mucosa in children with Helicobacter pylori (Н.pylori) infection. The aim of the study was to investigate the role of mechanisms of H.pylori lipopolysaccharide recognition in the development of local inflammation of the gastric mucosa in children with Н.pylori infection. We observed 55 children between the ages of 10 to 16 years with chronic H.pylori-associated gastroduodenitis (28 patients, study group) and patients with chronic gastroduodenitis non-associated with H.pylori (27 children, comparison group) in the acute stage. It is shown that the basis of an infectious-inflammatory process caused by Н.pylori, and unfavorable clinical course is functional deficiency is non-specific mechanisms of protection of the gastrointestinal tract. Features of expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) in the biopsy sample of the gastric mucosa and the protein sCD14 content in blood serum are demonstrated for children with chronic gastroduodenitis in the acute stage. It is shown that the development of chronic gastroduodenitis associated with Н.pylori in children is accompanied by increased TLR4 expression in biopsy specimens of gastric mucosa, which is a key sensor for Н.pylori lipopolysaccharide, and low levels of TLR4-accessory sCD14 protein.


Ключевые слова

хеликобактерная инфекция, дети, TLR4, sCD14.

хелікобактерна інфекція, діти, TLR4, sCD14.

Helicobacter pylori infection, children, TLR4, sCD14.

Введение

Открытие Barry Marshall и Robin Warren в 1983 году Helicobacter pylori (H.pylori) и признание последней как этиологического инфекционного фактора развития воспаления слизистой оболочки желудка обусловило активное изучение особенностей патогенеза и течения H.pylori-ассоциированных заболеваний [1]. В предупреждении возникновения инфекционного процесса и элиминации патогенов, в том числе Н.pylori, ведущую роль играет система неспецифической защиты макроорганизма. Молекулярные механизмы, индуцирующие воспалительный процесс слизистой оболочки желудка в ответ на инфицирование H.pylori, до настоящего времени остаются недостаточно изученными. Реакция макроорганизма на внедрение H.pylori обусловлена сложным взаимодействием факторов вирулентности H.pylori, компонентов мукозальной защиты и иммунной системы макроорганизма, нутритивными, экологическими и другими факторами.

Защита макроорганизма от патогенных инфекционных агентов обусловлена функционированием двух взаимосвязанных иерархических иммунных систем — неспецифической врожденной и специфической адаптивной. Неспецифические механизмы врожденного иммунитета представляют филогенетически более древнюю систему защиты организма от агрессивного воздействия микроорганизмов в сравнении с адаптивной иммунной системой. В отличие от специфического ответа иммунной системы, для развития которого требуется определенное время, реакция неспецифических механизмов защиты практически мгновенная.

Ведущим принципом функционирования врожденных механизмов неспецифической противоинфекционной защиты является обнаружение образ-распознающими рецепторами (pattern-recognition receptors, PRR) молекулярных эволюционно консервативных структур — патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) инфекционных агентов. Наиболее известными PAMP являются структурные компоненты наружной мембраны: липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) грамотрицательных бактерий; тейхоевая и липотейхоевая кислоты преимущественно грамположительных бактерий; пептидогликаны грамположительных и грамот­рицательных бактерий; липоарабиноманноза микобактерий, а также зимозан грибов; цитозин-гуанин-последовательности бактериальных ДНК, одно- и двуспиральные вирусные РНК. Каждый инфекционный агент характеризуется уникальной комбинацией PAMP, которая взаимодействует с определенными PRR макроорганизма, что обусловливает возникновение особенностей воспалительного процесса, ассоциированных с этиологией заболевания [2–4]. Все идентифицированные до настоящего времени виды PRR характеризуются способностями распознавать PAMP независимо от стадии жизненного цикла патогенных инфекционных агентов и конститутивно экспрессироваться клетками макроорганизма, причем их экспрессия не связана с механизмами иммунной памяти [2, 5].

Разнообразие PRR представлено совокупностью солютабных и клеточно-ассоциированных (мембранных, цитоплазматических) рецепторов распознавания образов. Сигнальные трансмембранные Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors — TLR) занимают центральное место в многоуровневой системе распознавания PAMP. Основные клинические эффекты связаны с функционированием PRR, в частности TLR-рецепторов, и TLR-аксессуарных молекул, прежде всего липополисахарид-связывающего белка (LBP), CD14, MD2. TLR-рецепторы регулируют активацию врожденного иммунитета, а также обеспечивают взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антигенпрезентирующие клетки (дендритные клетки, макрофаги).

Наиболее представительными РАМР грамот­рицательных бактерий являются липополисахариды (LPS) — структурные компоненты наружной мембраны, в том числе Н.pylori — ведущий возбудитель хронической гастродуоденальной патологии у детей.

Раскрытие молекулярных механизмов неспецифической защиты врожденного иммунитета, в частности роли TLR-рецепторов и TLR-аксессуарных молекул, позволило уточнить значение последних в развитии хеликобактерной инфекции у детей. LPS Н.pylori являются мощными триггерами воспалительного процесса слизистой оболочки желудка, действие которых предопределяет течение заболевания. В рекогниции LPS H.pylori также принимают участие и аксессуарные молекулы — LBP, CD14, MD2 [2, 5–7]. Первоначально, попадая на слизистую оболочку желудка, в экстрацеллюлярном пространстве LPS связывается с солютабным LBP, который функционирует как опсонин для гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанного белка CD14. Протеин CD14 представлен двумя формами — мембраносвязанной (mCD14) и солютабной (sCD14). Взаимодействие комплекса LPS / LBP с достаточным количеством солютабной формы sCD14 предопределяет его связывание и передачу сывороточным липопротеинам высокой плотности, которые служат своеобразным «стоком» LPS, что обеспечивает элиминацию LPS из организма и таким образом снижает выраженность LPS-ассоциированных эффектов. Комплекс LPS/LBP транспортируется в печень и связывается с mCD14 на поверхности макрофагов. Организация ассоциированного с цитоплазматической мембраной клетки мультимера LPS/TLR4/MD2 приводит к активации TLR4, интрадомен которого, взаимодействуя с адаптерной молекулой MyD88, обусловливает возбуждение каскада сигнальных молекул, индуцирующих продукцию провоспалительных цитокинов, хемокинов, активированных кислородсодержащих метаболитов и активных радикалов азота, формируя Th1 ответ [8, 9].

Именно адекватное возбуждение PRR обус­ловливает эффективную эрадикацию патогенного инфекционного агента, репарацию поврежденных тканей, выздоровление пациента, тогда как недостаточная активация PRR может стать причиной развития хронизации воспаления, а чрезмерная — возникновения аутоиммунного процесса [2]. В связи с этим понимание функционирования молекулярных механизмов неспецифического врожденного иммунитета, в частности TLR и TLR-аксессуарных молекул, — важнейшее условие для дальнейшего совершенствования методов лечения и профилактики заболеваний, в том числе хронической Н.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии.

Цель исследования: изучить роль механизмов распознавания LPS Н.pylori в развитии локального воспаления слизистой оболочки желудка у детей с хеликобактерной инфекцией.

Материалы и методы

Под наблюдением находилось 55 детей (30 мальчиков и 25 девочек) в возрасте от 10 до 16 лет, проходивших обследование и лечение в условиях гастроэнтерологического отделения коммунального учреждения «Днепропетровская городская детская клиническая больница № 1» Днепропетровского областного совета. Пациенты были выбраны методом случайных чисел и в зависимости от наличия Н.pylori были разделены на две группы.

В I (основную) группу вошли 28 (50,9 %) детей, больных хроническим Н.pylori-ассоциированным гастродуоденитом (ХГД HP «+»), во II (сравнения) — 27 (49,1 %) детей, больных хроническим гастродуоденитом, не ассоциированным с Н.pylori (ХГД HP «–»), в стадии обострения.

Для верификации диагноза наряду с выяснением жалоб и анамнеза заболевания, физикальным осмотром, общеклиническим лабораторным обследованием проведено эндоскопическое исследование пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) по общепринятой методике со взятием двух биоптатов слизистой оболочки (СОЖ) антрального отдела желудка. Для идентификации Н.pylori-инфекции использовали: быстрый уреазный «Хелпил»-тест и дыхательный «Хелик»-тест (ООО «АМА», Россия, Санкт-Петербург), определение в сыворотке венозной крови суммарных иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) к Ag СаgА белка H.pylori методом ИФА («Вектор-Бест», Россия). Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) применяли для оценки концентрации в сыворотке крови sCD14, используя ELISA test kit (Diaclone, France).

Уровень экспрессии гена TLR4 определяли методом полимеразной цепной реакции (PCR) в режиме реального времени (real-time) в НИИ генетических и иммунных основ развития патологии и фармакогенетики Высшего государственного учебного заведения Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия» (Полтава). Выделение общей РНК из клеток СОЖ проводили с помощью пакета реагентов «РИБО-золь-В» (AmpliSens, Россия). Для получения кДНК в реакции обратной транскрипции использовали праймер олиго (dT) 18. Анализировали экспрессию гена TLR4 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в присутствии красителя SYBR Green I, путем относительного количественного анализа. В качестве референтного гена использовали ген b-актина. Для анализа данных применяли относительный Ср метод с расчетом по формуле DСр = Ср (TLR4) – Ср (b-актина).

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью статистических программ Statgraf, Matstat. Достоверность различий оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента в случае нормального распределения данных и критерия Манна — Уитни в случае распределения, отличавшегося от нормального.

Результаты

Основная и группа сравнения обследованных пациентов по возрасту и полу достоверно не отличались друг от друга. Так, средний возраст детей, больных ХГД HP «+», был 13,48 ± 0,62 года, во II группе ХГД HP «–» — 12,78 ± 0,38 года. Мальчики в І группе детей составили 64,3 %, во II группе — 51,9 %; девочки — соответственно 35,7 и 48,1 %.

В клинической картине большинства наблюдаемых пациентов доминировали болевой, диспептический и астеновегетативный синдромы. Ведущим клиническим синдромом у детей обеих групп был болевой, однако его характер и выраженность отличались у детей с ХГД HP «+» по сравнению с пациентами ІІ группы .

Клинической особенностью у детей с ХГД HP «+» была более выраженная интенсивность болевого синдрома в отличие от группы с ХГД HP «–», который характеризовался наличием практически у 1/2 (13–46,4 %) пациентов боли язвенноподобного характера даже при отсутствии эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки. У пациентов с ХГД HP «–» интенсивность болевого синдрома была менее выраженной, чаще преобладала боль ноющего характера, чувство распирания в эпигастральной области. У детей обеих групп отмечалось усиление болей после нарушения диеты, физических нагрузок, боль была чаще периодической, чем постоянной. Диспептические симптомы также были более выраженными у детей с ХГД HP «+» в сравнении с пациентами группы ХГД HP «–» и чаще проявлялись снижением аппетита (в 1,4 раза); тошнотой, отрыжкой кислым воздухом (в 1,3 раза); метеоризмом, неустойчивостью стула со склонностью к запорам (в 1,5 раза). Астенический синдром (общая слабость, недомогание, снижение аппетита, повышенная утомляемость, нарушение сна, лабильность эмоционального тонуса) регистрировался у детей в обеих группах практически с одинаковой частотой.

У пациентов с выраженным болевым и диспептическим синдромом в сыворотке крови регистрировались резко положительные (1 : 40–1 : 80) титры анти-CagA-антител (r = 0,35 и r = 0,40 соответственно). Эндоскопические особенности хеликобактер-ассоциированной гастродуоденальной патологии были также взаимосвязаны с уровнем анти-CagA-IgA, -M, -G. Чем выше был титр анти-CagA-IgA, -IgM, -IgG (1 : 40–1 : 80), тем более выраженным был воспалительный процесс в СОЖ и ДПК: гастрит эрозивный и диффузный гиперпластический (r = 0,35), бульбит эрозивный и диффузный гиперпластический (r = 0,36).

Результаты исследований экспрессии TLR4 в биоптате СОЖ и концентрации sCD14 (нг/мл) в сыворотке крови детей, больных ХГД, показали, что экспрессия TLR4 в биоптате СОЖ детей, больных ХГД HP «+», была увеличена по сравнению с показателями детей, больных ХГД HP «–» (1,59 ± 0,12 и 1,28 ± 0,09 соответственно, Pu < 0,05). Уровень концентрации sCD14 был достоверно увеличен в сыворотке крови детей, больных ХГД HP «–», по сравнению с показателями в группе детей, больных ХГД HP «+» (15033,3 ± 1531,3 и 4009,5 ± 401,8 соответственно, Pu < 0,05).

Обсуждение

Результаты полученных нами исследований показали, что у детей с хроническим гастродуоденитом, ассоциированным с H.pylori, выраженность интенсивности клинико-эндоскопических проявлений и длительность поражения была ассоциирована с уровнем специфического иммунного ответа на фактор вирулентности СаgA H.pylori. Высокие титры антительного ответа свидетельствовали о наличии выраженного воспалительного процесса в СОЖ в периоде обострения заболевания, однако реакция приобретенного специфического иммунитета не является ведущей в саногенезе хеликобактерной инфекции, о чем свидетельствует отсутствие взаимосвязи скорости эрадикации H.pylori и уровня титров анти-CagA-IgA, -IgM, -IgG классов.

В научной литературе приведены противоречивые данные по поводу роли LPS Н.pylori и TLR4 в развитии хеликобактер-ассоциированного воспаления в СОЖ. Fredrik Backhed и соавт. [12] не показали участия TLR4-ассоциированного нарушения в развитии воспаления при хеликобактерной инфекции, так как в период обос­трения болезни на эпителиоцитах СОЖ им не удалось идентифицировать TLR4. Однако Leisa Mandell и соавт. [13] показали, что индукция цитокинов LPS Н.pylori опосредована активацией TLR4. Макрофаги, у которых отсутствует TLR4, остаются интактными после стимуляции LPS Н.pylori.

Полученные нами данные исследований свидетельствуют о том, что развитие Н.pylori-ассоциированного гастродуоденита у детей сопровождается повышением экспрессии TLR4 в СОЖ как ключевого сенсора LPS Н.pylori в отличие от гастродуоденита, не ассоциированного с Н.pylori, при котором отмечается увеличение уровня концентрации TLR4-аксессуарной молекулы sCD14.

Подобные данные представлены Shigetada Teshima и соавт. [10], показавшими в своих работах непосредственное влияние LPS Н.pylori на активность воспалительного процесса в СОЖ. В дальнейшем и другие исследователи показали, что при хеликобактерной инфекции именно с действием LPS ассоциирована продукция провоспалительных цитокинов, хемокинов и др., которые являются медиаторами воспалительного процесса в СОЖ и обусловливают характер течения заболевания [2, 11].

Полученные нами данные свидетельствуют, что наличие сниженного уровня sCD14 в сыворотке крови больных ХГД детей способствует инвазии Н.pylori, хеликобактерная инфекция развивается при наличии именно сниженного уровня sCD14. Более высокие уровни концентрации sCD14 у детей, больных ХГД HP «–» (по сравнению с показателями в группе детей, больных ХГД HP «+»), могут свидетельствовать, что хеликобактерная инфекция развивается при наличии низкой концентрации sCD14. По всей вероятности, показанное в некоторых исследованиях отсутствие возбуждения TLR4 при инфицированности H.pylori в большей степени свидетельствует не об отсутствии провоспалительного потенциала LPS H.pylori с TLR4, а о противовоспалительном эффекте протеина sCD14, который при достаточной концентрации секвестрирует LPS H.pylori от взаимодействия с TLR4 СОЖ.

По нашему мнению, низкие уровни концентрации sCD14, вероятно, способствуют взаимодействию комплекса LPS/LBP с мембрано­связанной формой протеина mCD14, который транспортирует его к особому белку — мембран-ассоциированному протеину MD2, и возбуждает TLR4. Этот факт подтверждается и данными S. Kumar Pachathundikandi и соавт. [14]: при развитии хеликобактерной инфекции отмечается повышенная экспрессия TLR4 и MD2 эпителиальными клетками. Мультимерный комплекс LPS/TLR4/MD2 способствует активации каскада сигнальных молекул и факторов транскрипции, которые усиливают экспрессию генов, что в дальнейшем приводит к активации синтеза и секреции провоспалительных цитокинов с развитием воспалительной реакции в СОЖ.

Заключение

Таким образом, в основе развития инфекционно-воспалительного процесса, вызванного H.pylori, и его неблагоприятного течения лежит функциональный дефицит неспецифических механизмов защиты СОЖ. Развитие воспалительного процесса в СОЖ у детей с хронической гастродуоденальной патологией зависит от взаимодействия LPS Н.pylori как с его ключевым сенсором TLR4, так и с TLR-аксессуарным протеином sCD14. Достаточный уровень sCD14 снижает выраженность LPS-ассоциированных провоспалительных эффектов H.pylori. В условиях низкой концентрации sCD14 LPS Н.pylori взаимодействует с mCD14, приводя к образованию комплекса LPS/TLR4/MD2, который активирует воспалительный процесс в СОЖ. Учитывая протективную роль в реализации врожденного иммунного ответа TLR и TLR-аксессуарных молекул, участвующих в рекогниции LPS H.pylori, в частности sCD14, новым направлением в лечении хеликобактерной инфекции у детей может быть медикаментозная регуляция активности TLR4 и продукции sCD14.


Список литературы

1. Talley N.J., Richter J. Nobel Prize in Medicine awarded to a Gastroenterologist in 2005 // Am. J. Gastroenterol. — 2006. — 101(2). — 211.

2. Абатуров А.Е., Волосовец А.П., Юлиш Е.И. Инициация воспалительного процесса при вирусных и бактериальных заболеваниях, возможности и перспективы медикаментозного управления. — Харьков: Новое слово. — 2011. — 344 с.

3. Сківка Л.М., Позур В.В. Реакції за участю toll-like-рецепторів у протективному імунітеті та за патологічних станів // Укр. біохім. журн. — 2008. — № 80(3). — С. 5-20.

4. Захарова Л.А. Эволюция адаптивного иммунитета // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. — 2009. — № 2. — С. 143-54.

5. Абатуров О.Є., Герасименко О.М. Модуляція активності TLR4 епітеліоцитів слизової оболонки шлунка при хелікобактерній інфекції // Современная педиатрия. — 2009. — № 6(28). — С. 141-146.

6. Akashi-Takamura S., Miyake K. TLR accessory molecules // Curr. Opin. Immunol. — 2008. — V. 20(4). — Р. 420-425.

7. Ferrero R.L. Innate immune recognition of the extracellular mucosal pathogen, Helicobacter pylori // Mol. Immunol. — 2005. — № 42(8). — С. 879-885.

8. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections / Ishii K.J., Koyama S., Nakagawa A., Coban C., Akira S. // Cell. Host. Microbe. — 2008. — V. 3(6). — P. 352-363.

9. Kawai T., Akira S. Toll-like receptor downstream signaling // Arthritis. Res. Ther. — 2005. — V. 7(1). — P. 12-19.

10. Type I Helicobacter pylori lipopolysaccharide stimulates toll-like receptor 4 and activates mitogen oxidase 1 in gastric pit cells / Kawahara T., Teshima S., Oka A., Sugiyama T., Kishi K., Rokutan K. // Infect. Immun. — 2001. — V. 69(7). — P. 4382-4389.

11. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. — 2006. — V. 124(4). — P. 783-801.

12. Gastric mucosal recognition of Helicobacter pylori is independent of Toll-like receptor 4 / F. Bаckhed, B. Rokbi, E. Torstensson, Y. Zhao, C. Nilsson, D. Seguin, S. Normark, A.M. Buchan, A. Richter-Dahlfors // J. Infect. Dis. — 2003. — V. 187(5). — P. 829-836.

13. Intact gram-negative Helicobacter pylori, Helicobacter felis, and Helicobacter hepaticus bacteria activate innate immunity via toll-like receptor 2 but not toll-like receptor 4 / L. Mandell, A.P. Moran, A. Cocchiarella, J. Houghton, N. Taylor, J.G. Fox, T.C. Wang, E.A. Kurt-Jones // Infect. Immun. — 2004. — V. 72(11). — P. 6446-6454.

14. Induction of TLR-2 and TLR-5 expression by Helicobacter pylori switches cagPAI-dependent signaling leading to the secretion of CXCL8/IL-8 and TNF-a / Kumar Pachathundikandi S., Brandt S., Madassery J., Backert S. // PLoS One. — 2011. — V. 6(5). — e19614.


Вернуться к номеру